獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞系后，即可根據(jù)需要大量單抗，以用于不同目的。

一、單抗的大規(guī)模制備

    目前大量制備單抗的方法主要有兩大系統(tǒng)，一是動(dòng)物體內(nèi)法，這是國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室所廣泛采用；另一是體外培養(yǎng)法。

1、動(dòng)物體內(nèi)單抗的方法

    迄今為止，通常情況下均采用動(dòng)物體內(nèi)單抗的方法，鑒于絕大多數(shù)動(dòng)物用雜交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與同品系的脾細(xì)胞融合而得，因此使用的動(dòng)物當(dāng)然BALB/c小鼠。本方法即將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高?？梢娫摲ú僮骱啽?、經(jīng)濟(jì)，不過，腹水中?；煊行∈蟮母鞣N雜蛋白（包括Ig），因此在很多情況下要提純后才能使用，而且還有污染動(dòng)物病毒的危險(xiǎn)，故而用SPF級(jí)小鼠。

（1）材料：

a. 成年BALB/c小鼠。

b. 降植烷（Pristane）或液體石蠟。

c. 處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞。

（2）方法：

a. 腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.3-0.5ml。

b. 7-10天后腹腔接種用PBS或無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠5×105/0.2ml。

c. 間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時(shí)，皮膚有緊張感，即可用16號(hào)針頭采集腹水，一般可連續(xù)采2-3次，通常每只小鼠可采 5-10ml腹水；

d. 將腹水離心（2000r/min 5分鐘），除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測定抗體效價(jià)，分裝，-70℃凍存?zhèn)溆?，或凍干保存?/p>

二、體外培養(yǎng)單抗的方法

    總體上講，雜交瘤細(xì)胞系并不是嚴(yán)格的貼壁依賴細(xì)胞（anchorage dependent cell，ADC），因此既可以進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng)，又可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞的單層細(xì)胞培養(yǎng)法是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室zui常用的手段，即將雜交瘤細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，以含10-15%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞濃度以1×106-2×106/ml為佳，然后收集培養(yǎng)上清，其中單抗含量約10-50ug/ml。顯然，這種方法制備的單抗量極為有限，無疑是不適用于單抗的大規(guī)模。要想在體外大量制備單抗，就必須進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的大量（高密度）培養(yǎng)。單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量越多，細(xì)胞存活時(shí)間越長，單抗的濃度就越高，產(chǎn)量就越大。

    目前在雜交瘤細(xì)胞的大量培養(yǎng)中，主要有兩種類型的培養(yǎng)系統(tǒng)。其一是懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，采用轉(zhuǎn)瓶或發(fā)酵罐式的生物反應(yīng)器，其中包括使用微載體；其二是細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)，包括中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。

1、懸浮培養(yǎng)法

    目前小規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，通過攪拌使細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)；而大規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用發(fā)酵式的生物反應(yīng)器，美國、加拿大、法國和德國等幾家公司這類反應(yīng)器，其培養(yǎng)方式可分為純批式、流加式、半連續(xù)式和連續(xù)式。

2、微載體培養(yǎng)法

    微載體（Microcarrier）是以小的固體顆粒作為細(xì)胞生長的載體，在攪拌作用下微載體 懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞則在固體顆粒表面生長成單層?？捎米骷?xì)胞大量培養(yǎng)的微載體主要以交聯(lián)瓊脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作為基質(zhì)的產(chǎn)品，其中以 Cytodex I，Biosilon和Superbeads為好。微載體培養(yǎng)的基本方法上與懸浮培養(yǎng)相同。近來的研究表明，該法是雜交瘤細(xì)胞大量培養(yǎng)的理想途徑之一。

3、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

    該系統(tǒng)由中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動(dòng)泵等組成。用于細(xì)胞培養(yǎng)的中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯-丙烯復(fù)合物、多聚碳酸硅等材料制成，外徑一般為100-500um，壁厚25-75um，壁呈海綿狀，上面有許多微孔。中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，其孔徑只允許營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物出入，而對(duì)細(xì)胞和大分子物質(zhì)（如單抗等）有滯留作用。目前使用的中空纖維生物反應(yīng)器分為柱式、板框式和中心灌流式。盡管該培養(yǎng)系統(tǒng)在大規(guī)模單抗時(shí)成本較低，并可獲得高產(chǎn)量高純度的抗體，由于設(shè)備價(jià)格昂貴，限制了其使用范圍。

4、微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

    該系統(tǒng)是先將雜交瘤細(xì)胞微囊化，然后將此具有半透膜的微囊置于培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，一定時(shí)間后，從培養(yǎng)液中分離出微囊，沖洗后打開囊膜，離心后即可獲得高濃度的單抗。

    總之，上述四種體外培養(yǎng)單抗的方法仍處在發(fā)展之中；隨著研究的不斷深入和技術(shù)的完善，它們將會(huì)在單抗的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中發(fā)揮越來越大的作用。

三、雜交瘤細(xì)胞的無血清培養(yǎng)

    雜交瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)絕大多數(shù)應(yīng)用DMEM或RPMI-1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10-20%胎?；蛐律∨Ｑ?。基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要提供各種氨基酸、維生素、葡萄糖、無機(jī)鹽、各種合成核酸和脂質(zhì)的前體物質(zhì)。而血清主要供給雜交瘤細(xì)胞等各種營養(yǎng)成分，血清中的激素可刺激細(xì)胞生長，其中的許多蛋白質(zhì)能結(jié)合有毒性的離子和熱源質(zhì)而起解毒作用，同時(shí)這些蛋白質(zhì)對(duì)激素、維生素和脂類有穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用。但是，血清中含有上百種的蛋白質(zhì)，這給單抗的純化帶來的麻煩，而未純化的含有異種蛋白的單抗用于動(dòng)物治療可誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)；加之，血清來源有限；每批血清之間質(zhì)量差異較大，直接影響結(jié)果的穩(wěn)定性，同時(shí)血清是雜交瘤細(xì)胞發(fā)生支原體污染的zui主要來源之一，而且價(jià)格較貴，為了克服血清的這些缺點(diǎn)，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞越來越受到廣泛重視。

    無血清培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是用各種不同的添加劑來代替血清，然后進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)。目前已報(bào)道的各類無血清培養(yǎng)基有含有大豆類脂的、含有酪蛋白的、化學(xué)限定性的、無蛋白的、含有血清低分子量成分的無血清培養(yǎng)基，其中一部分已有產(chǎn)品出售。綜合這些無血清培養(yǎng)基，約有幾十種不同的添加劑可用于無血清培養(yǎng)基，在其中至少必須添加胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺這三種成分，才能起到類似血清的作用，其他較重要的添加劑包括白蛋白、亞油酸和油酸、抗壞血酸以及錳等一些微量元素。

    采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞制備單抗，有利于單抗的純化，有助于大規(guī)模，可減少細(xì)胞污染的機(jī)會(huì)，且成本較低。但無血清培養(yǎng)細(xì)胞的率低、細(xì)胞密度小，影響了單抗的產(chǎn)量；同時(shí)無血清培養(yǎng)基還缺少血清中保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境中蛋白酶損傷的抑制因子等。盡管如此，無血清培養(yǎng)基終究會(huì)成為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的理想的培養(yǎng)基。