青海發光桿菌菌種保藏方法操作步驟

1 培養基制備

1.1 器皿準備 培養基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養皿、燒杯、吸管等，經洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。

1.2 溶解培養基配料 先在燒杯中放適量水，按培養基配方稱取各項材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，zui后加足水量，攪拌均勻。

1.3 調pH值 配料溶解后將培養基冷卻至室溫，根據要求加稀酸（0.1mol/L鹽酸）或稀堿調pH值。加酸或堿液時要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導致測量不準確和營養成分被破壞。

1.4 加凝固劑 配制固體培養基時需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補足所蒸發水分。

1.5 過濾分裝 在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養基趁熱過濾并分裝。斜面培養基分裝量約為試管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培養基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過程中勿使培養基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。

1.6 包扎標記 將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養基名稱及配制日期。

1.7 滅菌 根據要求將培養基滅菌，通常蒸汽滅菌為121℃，15～20min。

1.8 斜面擺放 滅菌后及時擺放斜面，斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。

1.9 無菌檢查 將滅菌的培養基放入培養箱中作無菌檢驗，通常30℃培養1～3天。無菌檢查合格后將其保存于4℃下備用。

2接種

2.1 斜面接種

2.1.1 點接

把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。

2.1.2 中央劃線

從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細菌和酵母菌等。

2.1.3 稀波狀蜿蜒劃線法

從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴散的細菌，也適用于部分真菌。

2.1.4 密波狀蜿蜒劃線法

從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細胞，適用于細菌和酵母菌等。

2.1.5 挖塊接種法

挖取菌絲體連同少量培養基，轉接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔子菌類真菌。

2.2 穿刺接種

用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細菌和酵母菌等。

2.3 液體接種

挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養基中。

3 培養

將接種后的培養基放入培養箱中，在適宜的條件下培養至細胞穩定期或得到成熟孢子。細菌培養溫度一般為30～37℃，真菌培養溫度一般為25～28℃。 4 保藏 培養好的菌種于4～6℃保存，根據要求每3～6個月移植一次。

某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須1～3個月移植一次。 保藏濕度用相對濕度表示，通常為50%～70%。 斜面菌種應保藏相繼三代培養物以便對照，防止因意外和污染造成損失。